Improved CRISPR/Cas9 gene editing in primary human myoblasts using low confluency cultures on Matrigel – 효율적인 유전자 편집을 위한 조건 최적화 연구 리뷰

14min-ag0 2025. 4. 16.

본 리뷰에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 인간 원초성 근아세포(primary human myoblasts)의 유전자 편집 효율을 극대화하기 위한 조건을 탐색한 연구를 소개한다. 특히, 세포 밀도(confluency)와 배양 플레이트의 기질 코팅 여부(Matrigel 사용 여부)가 유전자 편집 효율에 어떤 영향을 미치는지를 실험적으로 규명하였다. 본 연구는 기존의 상용화된 프로토콜이 제공하지 못하는 세부 조건들—예를 들어 낮은 세포 밀도와 Matrigel 코팅—이 실제로 CRISPR/Cas9 시스템의 전달 및 편집 성공률을 크게 향상시킬 수 있음을 실증적으로 보여준다. 이 연구는 단순한 방법론 개선을 넘어서, 인간 골격근 세포의 분자 생물학적 연구 및 질병 모델링에서 더욱 신뢰할 수 있는 유전자 조작 환경을 제공할 수 있는 중요한 전환점을 마련한다.

연구 배경 및 중요성

CRISPR/Cas9 기술은 유전체 편집 분야에서 핵심적인 도구로 자리 잡았으며, 다양한 질병 모델 제작 및 치료법 개발에 활용되고 있다. 그러나 이 시스템을 다양한 세포 유형에 적용하는 데 있어 효율적인 전달(transfection)은 여전히 도전 과제로 남아 있다. 특히, 인간 원초성 근아세포는 유용한 근육 연구 모델이지만, 전형적으로 형질도입 효율이 낮고 생존률 또한 낮아 연구 적용에 한계가 있었다. 이에 따라 본 연구는 이러한 문제를 해결하기 위해 기존 상용 프로토콜의 한계를 지적하고, 보다 효율적인 조건을 탐색하고자 하였다.

연구 목적 및 배경

본 연구의 목적은 인간 원초성 근아세포에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전자 편집 효율을 향상시킬 수 있는 배양 조건을 규명하는 것이다. 특히, 세포 밀도와 Matrigel 기질 코팅이 형질도입 효율 및 편집 효율에 미치는 영향을 분석하였다. 이로써 상용 프로토콜보다 훨씬 높은 효율을 제공하는 간단하고 경제적인 유전자 편집 방법을 제시하고자 하였다.

연구 방법

세 가지 다른 기증자로부터 유래된 인간 원초성 근아세포 사용
세포 밀도: 고밀도(~80%)와 저밀도(~40%)로 분리
Matrigel 코팅 여부: 코팅된 플레이트(Matpos)와 비코팅 플레이트(Matneg)
CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 Lipofectamine CRISPRMAX를 통해 전달
타겟 유전자: MYF5, MYOD1, GREM1
전달 효율은 형광 라벨(tracrRNA-ATTO 550) 및 FACS 분석으로 평가
편집 효율은 TIDE 알고리즘과 Sanger 시퀀싱으로 분석

실험은 12-well 플레이트에서 수행되었고, 동일한 조건에서 3개의 서로 다른 기증자 유래 세포에 대해 반복되었다. 전사체 분석은 qPCR로 수행되었으며, 유전자 발현 억제 여부를 확인하였다.

주요 발견 및 결과

본 연구는 저밀도에서 Matrigel 코팅이 된 플레이트에서 형질도입 및 유전자 편집 효율이 가장 높음을 입증하였다. 평균적으로 편집 효율은 52.4%에 달했으며, 최대 93.8%까지 도달했다. 이는 기존 상용 프로토콜보다 4배 이상 높은 수치였다. 형질도입 효율과 편집 효율은 부분적으로 상관관계가 있었으나, 편집 효율은 단순한 형질도입율 이상으로 향상되었음을 확인하였다.

실험 결과 요약

조건	형질도입 효율(%)	편집 효율(%)	최대 편집 효율(%)
Lo/Matpos	95.1 ± 2.58	52.4 ± 17.8	93.8
Hi/Matpos	87.9 ± 5.07	32.8 ± 7.1	–
Lo/Matneg	74.4 ± 2.17	10.8 ± 5.4	–
Hi/Matneg	75.4 ± 6.26	12.2 ± 7.0	–

가장 효과적인 편집은 낮은 세포 밀도와 Matrigel 코팅이 결합된 조건에서 나타났으며, GREM1 유전자는 MYF5 및 MYOD1보다 평균적으로 더 높은 편집 효율을 보였다.

한계점 및 향후 연구 방향

본 연구는 단일 가이드 RNA를 각 유전자에 사용했으며, 가이드별 효율 차이는 고려되지 않았다. 또한, 단백질 수준의 변화는 평가되지 않았으며, 이는 형광 단백질 신호만으로 RNP 전달 여부를 판단했기 때문이다. 향후 연구에서는 다양한 가이드를 테스트하고, 편집 효율과 함께 단백질 발현 분석도 병행하여 보다 포괄적인 분석이 필요하다.

결론

본 연구는 간단하면서도 고효율적인 CRISPR/Cas9 유전자 편집 프로토콜을 제시하였으며, 이는 특히 인간 원초성 근아세포처럼 형질도입이 어려운 세포 유형에 매우 유용하다. 이 방법은 다양한 세포 유형에도 확장 적용 가능성이 있으며, 유전학, 세포생물학, 치료제 개발 등의 분야에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

개인적인 생각

CRISPR 기술은 그 자체로 획기적인 도구이지만, 실험적인 맥락에서 성공 여부는 대부분 전달 시스템의 효율에 달려 있다. 그런 면에서 본 연구는 기존 상용화된 접근 방식이 모든 상황에 적절하지 않음을 명확히 보여주며, 연구자의 직관적이고 체계적인 최적화 노력이 얼마나 큰 차이를 만들어낼 수 있는지를 실증한다. 특히 Matrigel의 사용과 저밀도 조건이라는 단순한 변화가 수십 퍼센트의 효율 향상으로 이어지는 점은 실험실에서 실제 적용 가능한 매우 유용한 인사이트다. 단일 세포 클로닝이 어려운 원초성 세포에 대해 높은 비율의 bulk 편집이 가능하다는 점도 매우 실용적이며, 향후 유전자 기능 연구에 강력한 도구가 될 수 있다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q1. Matrigel은 모든 세포에서 유전자 편집 효율을 높이나요?
A1. 본 연구에서는 인간 원초성 근아세포에 대해 Matrigel이 유의미한 효과를 보였으나, 모든 세포 유형에 동일한 효과가 있는지는 추가 검증이 필요합니다.
Q2. 왜 낮은 세포 밀도가 더 좋은 결과를 주었나요?
A2. 세포 분열이 활발한 시기에 전사체 복합체가 세포핵에 유입되기 쉽기 때문입니다.
Q3. CRISPRMAX가 다른 전달체보다 나은가요?
A3. 본 연구에서는 CRISPRMAX가 높은 효율을 보였지만, 세포 유형과 실험 목적에 따라 최적의 전달체는 달라질 수 있습니다.
Q4. 편집된 세포를 어떻게 확인했나요?
A4. Sanger 시퀀싱과 TIDE 알고리즘을 통해 indel 빈도와 크기를 분석하였습니다.
Q5. 편집된 세포의 단백질 발현은 확인했나요?
A5. 낮은 발현량과 기술적 한계로 인해 단백질 수준 확인은 본 연구에서 진행되지 않았습니다.
Q6. 이 방법은 치료적 목적에도 적용될 수 있나요?
A6. 이론적으로 가능하나, 실제 치료 적용을 위해서는 안전성과 지속성에 대한 추가 검토가 필요합니다.

용어 설명

CRISPR/Cas9: 특정 DNA 염기서열을 절단하여 유전자 편집을 가능하게 하는 유전자 가위 시스템.
Primary Human Myoblasts: 성인 조직에서 유래한 분화 전 단계의 골격근 세포.
Transfection: 외부 유전물질을 세포 내로 도입하는 과정.
Matrigel: 세포외기질 성분으로 구성된 젤로, 세포 부착 및 분화를 촉진함.
Confluency: 배양 플레이트 상에서 세포가 얼마나 차 있는지를 백분율로 표현한 것.
RNP Complex: Cas9 단백질과 gRNA가 결합된 리보뉴클레오프로틴 복합체.
ATTO 550: 형광 표지로, CRISPR 시스템의 세포 내 유입 여부를 시각적으로 확인하는 데 사용됨.
Sanger Sequencing: DNA 서열 분석 방법으로, 유전자 편집 여부를 확인하는 데 활용됨.
TIDE: Sanger 시퀀싱 결과를 분석하여 유전자 편집 효율을 정량화하는 소프트웨어.
FACS: 세포를 형광 신호에 따라 분류하는 기술로, 형질도입된 세포의 비율을 측정할 수 있음.