Timing and duration of lipofection-mediated CRISPR/Cas9 delivery into porcine zygotes affect gene-editing events

이번 리뷰는 Lin 등 연구진이 2021년 BMC Research Notes에 발표한 연구로, 돼지 접합자(porcine zygotes)에 CRISPR/Cas9 시스템을 리포펙션(lipofection)을 통해 전달할 때, 그 전달 시점(timing)과 지속 시간(duration)이 유전자 편집 효율에 어떤 영향을 미치는지를 체계적으로 분석한 논문입니다. 이 연구는 기존의 미세주입이나 전기천공(electroporation)과 같은 고가 장비 기반의 방법 대신, 보다 간편한 유전자 전달 방식으로써 리포펙션을 활용하려는 시도에서 출발하였습니다. 특히 Zona pellucida(ZP)가 제거된 돼지 접합자에 GGTA1 유전자를 타겟으로 하는 gRNA와 Cas9을 리포펙션 방식으로 도입하여, 돌연변이 유도 여부 및 발생 단계(blastocyst formation)까지 분석함으로써 전달 타이밍과 시간 조절이 편집 효율에 미치는 정량적 영향을 검증하였습니다. 본 연구는 장비에 의존하지 않는 간단한 유전자 편집 시스템 개발의 가능성을 시사하며, 돼지를 모델로 한 질병 연구 및 이종이식 분야에서의 활용 가능성을 높이는 데 기여합니다.

연구 배경 및 중요성

돼지는 해부학적, 생리학적으로 인간과 유사하여 의생명과학 연구의 유망한 동물 모델입니다. CRISPR/Cas9을 활용한 돼지 유전자 편집은 주로 미세주입(microinjection)이나 전기천공(electroporation)을 통해 이루어져 왔지만, 이들 방식은 고도의 기술과 고가 장비를 필요로 하며, 실험자의 숙련도에 따라 편차가 큽니다. 따라서 보다 단순하고 장비 없이도 가능한 유전자 전달 방식이 필요합니다. 리포펙션은 지방질(liposome) 기반으로 핵산을 세포 내로 전달하는 기술로, 다양한 세포주에서 널리 사용되어 왔지만, 돼지 접합자에서의 적용 및 효율에 대한 최적화 연구는 부족했습니다. 본 연구는 이 공백을 메우고자, 리포펙션을 돼지 접합자에 적용하고, 시점과 처리 시간의 최적 조건을 규명하고자 했습니다.

연구 목적 및 배경

본 연구의 목적은 ZP가 제거된 돼지 접합자에 리포펙션을 통해 CRISPR/Cas9을 도입할 때, 편집 효율에 영향을 미치는 두 가지 주요 요인—1) IVF(수정) 시작 후 리포펙션의 도입 시점과 2) 리포펙션 처리 시간—을 실험적으로 규명하는 것입니다. 이를 위해 GGTA1 유전자를 표적으로 하는 gRNA와 Cas9을 포함한 리포펙션 용액을 다양한 시점의 접합자에 서로 다른 시간 동안 처리하고, 돌연변이 유도율과 배반포 형성률을 비교 분석하였습니다.

연구 방법

• 리포펙션 전달 시스템: Lipofectamine 2000을 사용하여 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함한 혼합 용액 준비
• ZP 제거: actinase-E를 이용해 접합자에서 ZP 제거 후 부드럽게 피펫팅하여 완전 제거
• 실험 1: IVF 시작 후 5h, 10h, 15h 시점의 ZP-free 접합자에 리포펙션 처리 (5시간)
• 실험 2: 10h 시점에서 ZP-free 접합자에 대해 2.5h, 5h, 10h, 20h 리포펙션 시간별 실험 수행
• 배반포 형성률 및 GGTA1 유전자 돌연변이 여부를 PCR 및 Sanger 시퀀싱으로 분석

각 실험은 동일한 구성의 리포펙션 혼합물(2 µL Lipofectamine + gRNA 200 ng/µL + Cas9 600 ng/µL)을 180 µL PZM-5에 희석하여 사용하였으며, 모든 배반포는 7일 동안 배양 후 분석되었습니다. 유전자 편집 여부는 PCR과 TIDE 분석을 통해 biallelic, mosaic, wild-type으로 분류되었습니다.

주요 발견 및 결과

실험 1에서 IVF 시작 5시간 시점의 접합자에서는 돌연변이 유도가 전혀 발생하지 않았습니다. 반면, 10시간 및 15시간 시점의 접합자에서는 각각 11.1% 및 10.0%의 편집률을 보여 비교적 유의미한 유전자 편집이 확인되었습니다. 실험 2에서는 2.5시간 리포펙션 처리 시 22.5%의 돌연변이 유도율이 나타났으며, 시간이 길어질수록 효율이 급격히 감소하였고, 20시간 처리군에서는 전혀 돌연변이가 유도되지 않았습니다. 이는 리포펙션 처리 시간의 연장에 따른 세포 독성이 편집 효율을 저해할 수 있음을 의미합니다.

실험 결과 요약

실험 조건	배반포 형성률 (%)	유전자 편집률 (%)	편집 유형
5h 시점, 5h 처리	15.1	0	전부 WT
10h 시점, 5h 처리	11.7	15.4	모자이크
15h 시점, 5h 처리	12.8	13.0	모자이크
10h 시점, 2.5h 처리	15.5	22.5	모자이크
10h 시점, 20h 처리	3.0	0	전부 WT

전반적으로 10h 시점에서 2.5~5h 처리 조건이 가장 높은 편집률을 보였으며, 20h 이상에서는 세포 독성의 영향으로 발달능과 편집 효율이 모두 현저히 감소하였습니다.

한계점 및 향후 연구 방향

리포펙션을 통한 유전자 편집 효율은 여전히 기존의 미세주입이나 전기천공 방식에 비해 낮으며, 모자이크 발생 비율이 높습니다. 또한 ZP 제거가 필수인 점은 실험적 번거로움을 야기할 수 있습니다. 향후에는 gRNA 및 Cas9 농도 최적화, 리포펙션 조성비율 개선, ZP 유지 조건에서의 전달 효율 확보 등 다양한 요소의 최적화가 필요합니다. 이 외에도 biallelic 편집률을 높이기 위한 동시 전달 시스템 개발도 중요 과제로 남아 있습니다.

결론

본 연구는 리포펙션 기반으로 CRISPR/Cas9 시스템을 ZP-free 돼지 접합자에 전달하는 간단한 유전자 편집 시스템이 실현 가능함을 입증하였습니다. 특히, 수정 10시간 이후의 접합자에 대해 2.5~5시간 정도의 짧은 처리 시간 내에서 가장 높은 편집 효율을 나타내었으며, 리포펙션의 세포 독성을 최소화할 수 있는 시간 조건의 중요성을 확인하였습니다. 본 시스템은 미세조작 장비 없이도 유전자 편집 돼지를 대량 생산할 수 있는 잠재적 대안으로 평가될 수 있습니다.

개인적인 생각

이 논문은 기술적 복잡성을 최소화하면서도 효율적인 유전자 편집 시스템을 구축하려는 시도가 매우 돋보입니다. 특히 리포펙션처럼 단순한 전달 기법이 생식세포 수준에서도 실제로 유의미한 유전자 편집을 유도할 수 있다는 사실은, 앞으로 장비 접근성이 낮은 실험실에서도 유전자 조작 모델 동물의 제작이 가능하다는 가능성을 열어줍니다. 다만 편집 효율 자체는 아직 미세주입에 비해 낮고 대부분이 모자이크임을 감안할 때, 이를 극복하기 위한 생물학적 최적화가 향후 연구의 핵심이 될 것입니다. 결국 이러한 연구가 축적된다면, 돼지를 활용한 질병 모델 개발 및 이종이식 연구에 큰 전환점을 제공할 수 있을 것입니다.

자주 묻는 질문(QnA)

• Q1: 리포펙션이란 무엇인가요?
  A1: 지방질로 구성된 리포솜을 이용해 핵산을 세포 내로 전달하는 유전자 전달 방법입니다.
• Q2: 왜 ZP를 제거해야 하나요?
  A2: ZP는 외부 물질의 유입을 차단하므로, 리포펙션 효율을 높이기 위해 제거합니다.
• Q3: 10시간 시점에서 유전자 편집이 잘 되는 이유는 무엇인가요?
  A3: 접합자의 염색질이 풀려 있는 pronucleus 단계이기 때문에 Cas9의 접근성이 증가합니다.
• Q4: 처리 시간이 길수록 왜 편집률이 낮아지나요?
  A4: Lipofectamine의 세포독성으로 인해 배아 발달능이 저하되고, 생존률과 편집률이 동반 감소합니다.
• Q5: 모자이크란 무엇인가요?
  A5: 편집된 세포와 편집되지 않은 세포가 공존하는 상태로, 유전자 편집의 일관성이 부족한 결과입니다.
• Q6: 이 방법은 사람에게도 적용할 수 있나요?
  A6: 현재는 동물 연구용이지만, 인간 배아에는 윤리적 문제와 규제상 제약이 있어 제한적입니다.

용어 설명

• CRISPR/Cas9: 특정 DNA 서열을 절단하여 유전자를 편집할 수 있는 유전자 가위 시스템입니다.
• Zona Pellucida (ZP): 난자와 접합자를 감싸는 투명대 구조로, 수정과정에서 중요한 역할을 합니다.
• Lipofection: 리포솜 기반으로 유전자나 RNA를 세포 내로 전달하는 비바이러스성 유전자 전달 방법입니다.
• IVF: 시험관 내 수정으로, 난자와 정자를 체외에서 수정시켜 배아를 형성하는 기술입니다.
• GGTA1: 인간과 면역적으로 반응하는 α-Gal 항원을 형성하는 유전자입니다.
• Blastocyst: 수정 후 5~7일차에 해당하는 포배기 배아로, 착상 전 단계입니다.
• Mosaic: 편집된 세포와 미편집 세포가 혼재된 유전자 편집 결과입니다.
• Lipofectamine 2000: 세포에 DNA, RNA를 전달하는 데 사용되는 상용 리포펙션 시약입니다.
• TIDE 분석: CRISPR 유도 인델을 분석하는 생물정보학 도구입니다.
• Sanger Sequencing: 유전자 서열을 해독하는 대표적인 염기서열 분석 기술입니다.