증폭 없이 장독해(long-read) 시퀀싱으로 밝혀낸 CRISPR-Cas9의 예기치 못한 오프타겟 활성

CRISPR-Cas9 유전체 편집 기술은 생명과학 연구 및 의학 분야에서 강력한 도구로 자리 잡았지만, 가이드 RNA(gRNA)의 비특이적인 결합으로 인한 오프타겟(off-target) 돌연변이가 지속적인 우려로 제기되어 왔습니다. 이에 본 논문은 PCR 증폭이 필요 없는 장독해(long-read) 시퀀싱 기술인 SMRT-OTS(PacBio 기반) 및 Nano-OTS(ONT 기반)를 이용하여 gRNA에 의해 유도된 Cas9 절단을 정밀하게 탐지할 수 있는 두 가지 새로운 방법을 제시합니다. 연구진은 이 기술들을 활용하여 기존 예측 알고리즘으로는 검출되지 않았던 오프타겟 절단 지점을 확인하였으며, 반복 서열이나 GC 함량이 높은 '어두운 유전체 영역(dark genomic regions)'에서도 Cas9 절단을 성공적으로 탐지하였습니다. 또한 실험적으로 유도된 HEK293 세포 및 인간 피부 섬유아세포에서의 비교 분석을 통해 in vitro에서의 Cas9 절단이 반드시 세포 내에서의 돌연변이로 이어지지 않음을 보여줌으로써, 정확한 gRNA 설계 및 사전 오프타겟 검출의 중요성을 강조합니다.

연구 배경 및 중요성

CRISPR-Cas9 시스템은 2013년 인간 세포에서의 유전체 편집 도입 이후로 비약적인 발전을 이룩하였습니다. 하지만 gRNA가 목표 이외의 유전체 위치에 결합하여 예기치 않은 돌연변이를 유발할 수 있다는 점은 치료적 활용에 있어 큰 제약이 됩니다. 특히, 기존의 컴퓨터 기반 예측 도구는 세포의 실제 유전체와 차이가 있는 참조 유전체를 기반으로 하기에 신뢰도가 낮을 수 있습니다. 본 연구는 증폭이 필요 없는 장독해 기술을 이용하여 오프타겟 절단을 실험적으로 검출하고자 하였으며, 기존 짧은 염기서열 기반 기술의 한계를 극복했다는 점에서 매우 중요합니다.

연구 목적 및 배경

본 연구는 기존의 오프타겟 예측 도구들이 가지는 한계점을 보완하고, PCR 증폭 없이 직접적으로 Cas9 절단 부위를 식별할 수 있는 실험적 방법을 개발하는 것을 목적으로 합니다. 이를 위해 PacBio 기반의 SMRT-OTS 및 ONT 기반의 Nano-OTS를 개발하였고, HEK293 인간 세포주 및 피부 섬유아세포를 활용하여 실제 Cas9 절단 부위를 고정밀도로 분석하였습니다.

연구 방법

• SMRT-OTS 및 Nano-OTS라는 두 가지 장독해 기반 오프타겟 시퀀싱 기법 개발
• HEK293 세포주 전체 유전체를 PacBio HiFi 시퀀싱으로 재구성 (18배 커버리지)
• 세 개의 gRNA(ATXN10, MMP14, NEK1 표적)를 이용한 in vitro Cas9 절단 실험 수행
• OTS 방법으로 도출된 절단 부위는 컴퓨터 알고리즘(CHOPCHOP 등)과 비교
• 섬유아세포에서 CRISPR 편집 후 장거리 증폭과 SMRT 시퀀싱을 통해 돌연변이 유무 분석

실험은 gRNA를 이용한 Cas9 절단 후, 해당 부위에서 SMRTbell 또는 나노포어 라이브러리를 구축하는 방식으로 진행되었습니다. 정밀한 분석을 위해 자체 개발한 ‘Insider’ 소프트웨어를 사용하여 다수의 read가 동일 위치에서 시작되는 패턴을 기반으로 Cas9 절단 부위를 판별하였습니다.

주요 발견 및 결과

두 기술 모두 기존의 오프타겟 예측 알고리즘으로는 검출되지 않았던 총 55개의 gRNA 절단 부위를 검출하였습니다. 그 중 25개는 CHOPCHOP 등의 예측 도구에서 완전히 누락된 것으로, 일부는 4개 이상의 mismatch 또는 indel mismatch를 포함하고 있었습니다. 또한 85%의 SMRT-OTS/Nano-OTS 검출 부위는 Digenome-seq이나 CIRCLE-seq 등의 기존 in vitro 기반 방법들과도 일치하였습니다. 하지만, 인간 피부 섬유아세포에서 동일한 gRNA로 유전자 편집을 수행한 결과, in vitro 상에서 예측된 오프타겟 위치에서는 실제 돌연변이가 유도되지 않았음을 확인하였습니다.

실험 결과 요약

gRNA	검출된 오프타겟 (SMRT-OTS)	검출된 오프타겟 (Nano-OTS)	두 기술 모두 일치
ATXN10	42개	54개	일치 다수
MMP14	27개	30개	일치 다수
NEK1	3개	50개	일치 다수

Nano-OTS는 더 많은 오프타겟을 검출하였으나, 일부 위치는 10~20bp 범위 오차를 보였고 SMRT-OTS는 더 정밀한 염기 수준 정보를 제공하였습니다. 두 방법이 모두 일치한 55개 부위는 고신뢰(off-target)로 간주되었습니다.

한계점 및 향후 연구 방향

Nano-OTS는 읽기 정확도가 낮아 절단 위치 예측 정밀도가 떨어질 수 있으며, SMRT-OTS는 데이터 생산 시간이 길고 비용이 상대적으로 높습니다. 또한 in vitro 절단이 반드시 세포 내 돌연변이로 이어지지는 않는다는 점에서, 실제 세포 기반 분석과 병행이 필요합니다. 향후에는 다중 gRNA 분석의 고도화, 고효율 Cas9 절단 조건 정립, 다양한 세포주 및 생체모델에 대한 적용이 이루어져야 합니다.

결론

본 논문은 기존의 짧은 염기서열 기반 기술로는 어려웠던 유전체 복잡 영역 내 Cas9 절단을 장독해 시퀀싱 기술을 통해 효과적으로 분석할 수 있다는 점을 보여주었습니다. SMRT-OTS와 Nano-OTS는 향후 gRNA 설계 검증, 유전자 치료의 안전성 평가, 그리고 개인 맞춤형 유전체 편집에 있어 필수적인 도구로 활용될 수 있을 것입니다.

개인적인 생각

이 논문은 CRISPR-Cas9 기술을 실제 임상에 적용하기 위해 반드시 해결해야 할 '오프타겟' 문제에 대한 매우 실용적인 접근법을 제시하고 있다는 점에서 매우 인상 깊습니다. 특히, 증폭 없이 장독해 시퀀싱을 통해 기존 예측 도구가 놓치는 부분을 보완했다는 점은 향후 유전체 편집 기술의 정확성을 획기적으로 향상시킬 수 있는 가능성을 보여줍니다. 한편, 실제 살아 있는 세포에서는 in vitro에서 검출된 절단이 돌연변이로 이어지지 않을 수 있다는 점에서, 오프타겟 분석 시 실험적 조건 설정의 중요성을 다시금 인식하게 됩니다. 궁극적으로 이 연구는 안전하고 정밀한 유전체 편집을 위한 기반 기술을 제시했다는 점에서 큰 의미가 있습니다.

자주 묻는 질문(QnA)

• Q: SMRT-OTS와 Nano-OTS의 차이는 무엇인가요?
  A: SMRT-OTS는 높은 정확도의 PacBio 시퀀싱을, Nano-OTS는 빠르고 휴대 가능한 ONT 시퀀서를 이용합니다.
• Q: 기존 오프타겟 예측 도구는 왜 정확하지 않나요?
  A: 실제 세포의 유전체가 참조 유전체와 다를 수 있으며, 알고리즘이 gRNA-DNA 결합을 정확히 모델링하지 못하기 때문입니다.
• Q: dark genomic region이란 무엇인가요?
  A: 짧은 염기서열로는 정렬이 어려운 반복적이거나 복잡한 유전체 구간을 의미합니다.
• Q: in vitro 오프타겟이 실제 돌연변이로 이어지지 않는 이유는 무엇인가요?
  A: 세포 내 크로마틴 구조, DNA 수선 기작, Cas9 농도 등이 영향을 미칠 수 있습니다.
• Q: gRNA 설계 시 개인 유전체를 반영해야 하나요?
  A: 예, 개개인의 SNV에 따라 Cas9의 결합 특성이 달라질 수 있어 고려가 필요합니다.
• Q: 이 기술은 임상에 어떻게 활용될 수 있나요?
  A: 유전자 치료 전 gRNA의 안전성을 검증하고, 오프타겟 위험을 줄이는 데 활용될 수 있습니다.

용어 설명

• CRISPR-Cas9: 특정 DNA 서열을 절단하는 유전자 편집 시스템
• gRNA: Cas9을 목표 DNA 위치로 안내하는 가이드 RNA
• Off-target: 의도된 표적 외의 위치에서 발생하는 유전자 편집
• Long-read sequencing: 수천 염기 이상의 길이를 읽을 수 있는 시퀀싱 기술
• SMRT-OTS: PacBio의 고정밀 단일분자 실시간 시퀀싱 기반의 오프타겟 탐지법
• Nano-OTS: Oxford Nanopore 기반의 빠른 오프타겟 탐지법
• HiFi reads: 높은 정확도의 PacBio 시퀀싱 읽기 결과
• PAM: Cas9 인식에 필수적인 DNA 인접 모티프 (보통 NGG)
• Indel: 염기 서열에서의 삽입 또는 결실
• Dark genomic region: 짧은 리드로는 정렬되지 않는 유전체의 복잡 영역